對于菌落試驗來說按照一般的步驟，可以把每個菌落挑出來進行培養提取質粒，然后質粒進行測序或者酶切驗證目的片段。但是從培養細菌到最后送測序，花費太多時間。如果說只有一個菌落去驗證，那工作量倒不是很大。但萬一有100個菌落就比較麻煩。那么我們就可以通過
PCR儀進行菌落PCR篩選。
基本步驟如下：
1.單菌落挑取
把LB培養基倒入排槍槽中，然后用排槍加400μL LB培養基到48孔深孔板，用鑷子拿已滅菌的小白槍頭挑取平板上的單菌落并放到48孔深孔板中，同時在48孔深孔板和相應的表單上做好記錄，注意對于藍白斑篩選的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜蓋好并做好相應標記（日期、板號等），用針頭在封口膜打孔，把它放在37搖床上搖一個小時。
2.菌落PCR反應
配置好PCR反應的反應體系，把配好的反應液加到96孔反應板中，用排槍加2.5μL的菌液到其中，注意在96孔反應板上做好標記。把96孔反應板放在PCR儀上蓋好橡膠墊，按照PCR反應條件設置反應程序，注意一定要把PCR儀的蓋子蓋緊。
3.瓊脂糖凝膠電泳
一般先配置1.0%-1.2%瓊脂糖凝膠（即稱1.2g的瓊脂糖加100ml的TAE），在96孔反應板每個管中加0.5μL的溴酚藍，震蕩均勻，然后點樣，電泳好的瓊脂糖凝膠拍照，命名保存。
4.判斷陽性克隆并測序
根據瓊脂糖凝膠電泳圖條帶來判斷陽性克隆，把陽性克隆的菌液進行擴大培養，進行測序驗證，看看是否有*正確的序列。
您的位置：